LRRK2-v-1 CAS 1234480-84-2 biološka aktivnost

In vitro   

Wild-Type in G2019S transtion rezultatov v 2,5 krat višji TR-FRET signala, ki jih je mogoče zaviralLRRK2-V-1na način, odvisen od odmerka, z vrednostmi IC50 0,08 μM in 0,03 μM, respectively [1]. LRRK2-v-1 je imel IC50 45 nM za zaviranje DCLK2 in kaže IC50 več kot 1 μM, ko se ocenjuje v biokemičnih testih za AURKB, CHEK2, MKNK2, MYLK, NUAK1, in PLK1. LRRK2-v-1 je potrjeno, da zavira MAPK7 z EC50 160 nM. LRRK2-in-1 induira odmerek odvisne inhibicije Ser910 in Ser935 fosforilacijo skupaj z izgubo 14-3-3 vezavo na divji tip LRRK2 in LRRK2 [G2019S] stabilno transfeciran v HEK293 celice [2]. LRRK2-IN-1 je zmerno citotoksična z IC50 49,3 μM v HepG2 celicah. LRRK2-IN-1 kaže Genotoksičnost v prisotnosti in odsotnosti S9 v 15,6 in 3,9 μM, respectively [3]. LRRK2-v-1 zavira proliferacijo, migracije, in indues celično smrt z žigov apoptoze HCT116 in AsPC-1 celic [4]..

In vivo    

LRRK2-IN-1 (100 mg/kg, IP) indugira defoshorilacijo LRRK2 v ledvicah miši [2]. Peritumoralna injekcija LRRK2-v-1 (100 mg/kg) povzroči znatno zmanjšanje obsega tumorja in težo AsPC-1 tumor xenocepljenk [4].

Vsebnost kinaze 

Aktivna GST-LRRK2 (1326-2527), GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527), GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) in GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527) encim se očisti z glutationom sepharose iz HEK293 celične lizata 36 h po prehodni transfekcija ustreznih konstruktov cDNA. Testi peptida kinaze, opravljeni v dvojniku, se nastavijo v skupni količini 40 μL, ki vsebuje 0,5 μg LRRK2 kinaze (ki pri približno 10% čistosti daje končno koncentracijo 8 nM) v 50 mM tris/HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20 μM Nictide, 0,1 μM [γ-32P] ATP (500 CPM/pmol) in označene koncentracije zaviralca, raztopljenega v DMSO. Po inkubaciji 15 min pri 30 ° c se reakcije odpovejo z madeže 35 μL reakcijske mešanice na P81 fosfocelulozno papir in potopitvijo v 50 mM fosforno kislino. Vzorci se temeljito oprajo in vključitev [γ-32P] ATP v Nictide je kvantificirana s štetjem Cerenkov. Vrednosti IC50 se izračunajo z Grafpad Prism z nelinearno regresijsko analizo.

Celične vsebnosti

Celice (104 celic na dobro) so semeni v 96-Well tkiva kulture ploščo v trojniku. Celice so kultivirane v prisotnosti LRRK2-IN-1 z DMSO kot vozilo na 0, 0,31, 0,63, 1, 2, in 5, 10 in 20 μM. 48 h po obdelavi se vsakemu vodnju doda 10 μL MTT reagenta TACS in celice inkubira pri 37 ° c, dokler temna kristalna oborica ne postane vidna v celicah. 100 μL 266 mM NH4OH v DMSO nato doda vodnjakov in se postavi na ploščo stresalniku pri nizki hitrosti za 1 minuto. Po stresanju se plošča lahko inkubira za 10 minut zaščitena pred svetlobo in OD550 za vsako dobro se bere z imunološki preskus bralec. Rezultati so povprečni in izračunani kot odstotek kontrolnika DMSO (vozilo) +/-standardna napaka povprečne.

Živali admin

LRRK2-V-1se raztopi v Kaptisol in ga daje intraperitonealno injekcijo v divji tip moškega C57BL/6 miši v odmerku 100 mg/kg. Kontrolne miši injiciramo z enakim volumnom zdravila Captisol. Na 1 in 2 h časovnih točkah, miši se ugasne z materničnega vratu izpah in ledvice in možganskega tkiva hitro razkošena in snap-zamrznjene v tekočem dušiku.

Sklicevanja

[1]. hermanson SB, et al. presejalni za roman LRRK2 inhibitorji uporaba visoko prepustno TR-FRET celični test za LRRK2 Ser935 Fosforilacija. PLoS ena. 2012; 7 (8): e43580. EPub 2012 avgust 28.

[2]. Deng, Xianming., et al. Karakterizacija selektivnega zaviralca Parkinsonove bolezni kinaze LRRK2. Naravna kemična biologija (2011), 7 (4), 203-205.

[3]. koshibu K, et al. alternativa LRRK2-v-1 za farmakološke študije Parkinsonove bolezni. Farmakologija. 2015; 96 (5-6): 240-7.

[4]. weygant N, et al. majhna molekula kinaze inhibitor LRRK2-IN-1 dokazuje močno aktivnost proti kolorektalnega in raka trebušne slinavke z zaviranjem doublecortin podobnih kinaze 1. Rak mol. 2014. maj 6; 13:103